艱難梭菌（TCD-B）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）
商品名稱(chēng)：艱難梭菌（TCD-B）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光 PCR 法）
Name ：Diagnostic Kit for Clostridiumdifficile tcd-B gene （Real-Time PCR Method）
【包裝規(guī)格】50T/盒
本試劑盒適用于檢測(cè)從水樣糞便等標(biāo)本中分離出的毒素 B 型艱難梭菌，用于艱難梭菌的輔助診斷，其檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考。
本試劑盒用一對(duì)艱難梭菌毒素 B 基因特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)艱難梭菌毒素 B 基因進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。
包裝規(guī)格 | 50T/盒 |
TCD-B 反應(yīng)液 | 500μL×2 管 |
酶液 | 50μL×1 管 |
TCD-B 陽(yáng)性質(zhì)控品 | 50μL ×1 管 |
陰性質(zhì)控品 | 250μL ×1 管 |
說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。
-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月。
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
取水樣便 0.5~1mL
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理
13000rpm 離心 2min，去盡上清
推薦采用上海烜雅生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取，請(qǐng) 按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 | TCD-B 反應(yīng)液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21μL/管。
將步驟 1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。
4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；
熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。
4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
步驟 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時(shí)間 | 收集熒光信號(hào) |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值（一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)）、stop 值（一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)），以及
Threshold 的 Value 值（上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照），重新分析結(jié)果。
陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線；
可疑：檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線， 判定為陽(yáng)性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。
陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無(wú) Ct 值顯示；
陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
1. 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
2. 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；
3. 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；
4. 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
5. 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
6. 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；
7. 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
1. 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；
2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；
3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服；
6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
7. 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；
8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。
企業(yè)名稱(chēng)：上海晅科生物科技有限公司
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