熒光探針法PCR試劑盒說明書：
【試劑盒簡(jiǎn)介】
熒光探針法PCR試劑盒采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)禽組織、分泌物和排泄物中所有亞型的AIV，適用于AIV的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
【原理】
利用吸附柱提取RNA作為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以引物為起點(diǎn)合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA鏈；然后在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。將擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行電泳、染色后，在紫外燈下，肉眼可見DNA片段的擴(kuò)增帶。
大腸菌O157檢測(cè)試劑盒(玻片乳膠凝集反應(yīng)法)
大腸埃希氏菌血清
志賀氏菌診斷血清
無菌脫纖維馬血
無菌脫纖維兔血
【試劑盒組份】
| 1. 生理鹽水 | 20mL | 8. 吸附柱和收集管 | 10套 |
| 2. 裂解液 | 6mL | 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15個(gè) |
| 3. 洗滌液A | 7mL | 10. RT-PCR 反應(yīng)液A | 180μL |
| 4. 洗滌液B | 7mL | 11. RT-PCR 反應(yīng)液B | 50μL |
| 5. 洗脫液 | 500μL | 12. 50 倍TAE 電泳緩沖液 | 20mL |
| 6. 陰性對(duì)照 | 300μL | 13. 染色液 | 10μL |
| 7. 陽性對(duì)照 | 300μL | | |
注：塑料袋內(nèi)試劑(陽性對(duì)照、RT-PCR反應(yīng)液A和B)-20℃凍存，裂解液2-8℃冷藏，其他室溫保存。
【熒光探針法PCR試劑盒操作方法】
一、樣品制備
1樣品采集：：病死或撲殺的禽，取肺、脾、腦等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，放于50%甘油生理鹽水中或用注射器取血5mL，2～8℃保存。(要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。)
2.1組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物；然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取100µL上清于1.5mL滅菌離心管中。2樣品處理：
2.2全血樣品的處理：待血凝后取100µL血清于1.5mL滅菌離心管中。
2.3陽性對(duì)照的處理：取陽性對(duì)照100µL于1.5mL滅菌離心管中。
2.4陰性對(duì)照的處理：取陰性對(duì)照100µL于1.5mL滅菌離心管中。
二、病毒RNA的提取
1.取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，分別加入450µL裂解液，充分顛倒混勻，室溫靜置3min。
2.加入275µL無水乙醇，輕輕混勻。
3.將混合液吸入吸附柱中(吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時(shí)堵塞吸附柱)，10,000rpm離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。
4.向吸附柱中加入500µL洗滌液A，10,000rpm離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。
5.向吸附柱中加入500µL洗滌液B，10,000rpm離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。
6.空柱10,000rpm離心2min。
7.將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5mL離心管中，在膜中央加入30µL洗脫液，室溫靜置2min，10,000rpm離心1min，獲得總RNA。
三、RT-PCR
1.反應(yīng)體系：分別取14µLRT-PCR反應(yīng)液A(用前混勻)、4µLRT-PCR反應(yīng)液B(用前混勻)和2µL模板RNA，混勻。
2.反應(yīng)程序：在PCR儀上運(yùn)行以下程序：42℃45min，94℃3min；94℃30s、53℃30s、72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
四、電泳
1.制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
2.電泳：待膠凝固后，取5µLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
3.染色：取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL，加入10µL染色液，混勻后將膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結(jié)果。
【結(jié)果判斷】
陽性對(duì)照出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無帶出現(xiàn)(引物帶除外)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶為新城疫病毒陽性，否則為陰性。
【需用但未提供的材料】
組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭(10µL、200µL、1000µL)。
【注意事項(xiàng)】
1.本試劑盒有效期為6個(gè)月，不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的組分不要混用。
2.所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存，使用時(shí)拿到室溫下，使用后立即放回。
3.注意防止試劑盒組分受污染。使用前將塑料袋內(nèi)試劑瞬離15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
4.嚴(yán)格按試劑盒說明書操作可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)等全部過程必須精確。
5.RNA提取過程中，應(yīng)戴口罩、勤換手套，盡量縮短操作時(shí)間。
6.所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處理，以免污染實(shí)驗(yàn)室。
