鼠疫桿菌(YP-PLA/CA/3A)熒光PCR檢測試劑盒說明書

【產品名稱】

通用名稱：鼠疫桿菌(YP)核酸擴增檢測試劑盒(PCR-三色熒光探針法)

Name ：Diagnostic Kit for Yersinia Pestis DNA （PCR tripartite Fluorescence Probing）

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預期用途】

本試劑盒適用于檢測全血等樣本中的鼠疫桿菌，用于鼠疫桿菌感染的輔助診斷，其檢測結果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對 PLA 基因特異性引物，一對 3A 基因特異性引物，一對 偽CAFL 基因特異性引物，分別結合一條特異性熒光探針，用三色熒光 PCR 技術對鼠疫桿菌(YP)DNA 進行體外擴增，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

核酸提取液 1.5ml×2 管

酶液 50μl×1 管

YP 反應液 1.0ml×1 管

YP 陽性質控品 50μl ×1 管

陰性質控品 250μl ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件和有效期】

試劑盒保存于-20±5℃，有效期 12 個月；

避免反復凍融，凍融次數(shù)不超過 5 次；試劑開瓶后，在室溫條件下放置時間不

應超過 8 小時；運輸采用干冰（或者冰袋）保持低溫，運輸時間不應超過 4 天。試

劑盒生產日期見產品標簽。

【適用儀器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ

Opticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本要求】

標本采集：用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管

保存運輸：上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過

6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

取抗凝血下層血細胞 50uL，加入 100uL 雙蒸水吹勻

1.2DNA 提取

1) 對上述處理好的標本加入等體積核酸提取液（固體標本加入50uL核酸提取液），

100℃恒溫處理 10 分鐘，13,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液轉移至新的 1.5ml

EP 管，-20℃保存；

2) DNA 的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產的 DNA 提取試劑

盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性

對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑 YP 反應液 酶液

用量（樣本數(shù)為 N） 20μl 1μl

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μl，分別加入相應的反

應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25ul；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）

NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycle

94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 結果分析判定

5.1結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出

現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍

內調節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上

下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

5.2 結果判斷

FAM通道為 PLA基因檢測結果，CY5 通道為3A基因檢測結果，VIC通道為 CAFL

基因檢測結果。

1) 陽性：檢測樣本任意一個通道 Ct 值三個小于等于 35.0，且曲線有明顯的指

數(shù)增長期；

2) 可疑：檢測樣本任意一個通道 Ct 值大于 35.0 且小于 40.0，重復一次實驗，

如果 Ct 值仍小于 40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性；

3) 陰性：三個通道均檢測不到樣本 Ct 值。

6. 檢測方法的局限性

Ø 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；

Ø 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

Ø 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

Ø 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或

定量檢測不準確的結果；

Ø 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7. 質控標準

陰性質控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；

以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

8. 產品性能指標

陰陽性參考品符合率：8 份陽性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合

率為 100％。

低檢測限：2.0×102copies/ml。

精密度：批內、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(shù)（CV）均≤3%。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，*混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

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