偽狂犬病毒通用型(PRV-gB)熒光PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：偽狂犬病毒通用型(PRV-gB)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)

Name ：Pseudorabies Virus gB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又稱豬皰疹病毒Ⅰ型、傳染性延髓麻痹病毒、奇癢癥病毒、奧葉茲基氏病病毒。是引起牛、羊、豬、犬和貓等多種家畜和野生動(dòng)物發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主要癥狀的皰疹病毒[1]。豬是偽狂犬病的自然宿主，對(duì)其危害大?？芍氯焉锬肛i流產(chǎn)，產(chǎn)死胎及胎兒干尸化。對(duì)初生仔豬則引起神經(jīng)癥狀，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)失調(diào)，麻痹，衰竭死亡，病死率 100%。成年豬多呈隱性感染，但可引起呼吸道癥狀[2]。病豬、帶毒豬及帶毒鼠類是本病的主要傳染源，病毒主要從病豬的鼻分泌物、唾液、乳汁和尿中排除，有的帶毒豬可持續(xù)排毒一年。

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光 PCR 原理，檢測(cè)偽狂犬病毒，對(duì)偽狂犬病毒引起的疾病及其并發(fā)癥的診斷及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)偽狂犬病毒gB基因高度保守區(qū)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針[3]。在反應(yīng)體系中含偽狂犬病毒gB基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放   熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性、定量分析。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

核酸提取液 1.5mL×2 管

酶液 50μL×1 管

PRV-gB 反應(yīng)液 1.0mL×1 管

PRV-gB 陽(yáng)性質(zhì)控品 50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管

注：

1）丌同批號(hào)試劑丌能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)丌超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺的豬，取腦、淋巴結(jié)、脾臟、肺臟等組織；待檢活豬，用棉拭子取鼻腔分泌物、唾液、乳汁等，置于 50%甘油生理鹽水中，或用注射器取血 5mL。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但丌能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)丌同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取

0. 5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；分泌物棉拭子直接取 100μL 提?。谎喝⊙?100μL 提取。

1.2DNA 提取

1)對(duì)上述處理好的標(biāo)本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000

rpm 離心 5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2)DNA 的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒

（離心柱提取法），請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；樣本總數(shù)每滿 7 份，則多配制 1 頭份 PCR 反應(yīng)液)，單個(gè)測(cè)試反應(yīng)液體系配制如下表：

試劑 PRV-gB 反應(yīng)液 酶液

用量（樣本數(shù)為 N） 20μL 1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.

加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）

NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào)

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、

stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0，丏明顯的擴(kuò)增曲線。

可疑：檢測(cè)通道 Ct 值>35.0，丏出現(xiàn)明顯曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果如果同樣出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴(kuò)增曲線則為陽(yáng)性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果無(wú) Ct 值丏無(wú)明顯的擴(kuò)增曲線。

6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性對(duì)照：無(wú)明顯擴(kuò)增曲線或無(wú) Ct 值顯示；

陽(yáng)性對(duì)照：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，丏 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

7.檢測(cè)方法的局限性

Ø樣本檢測(cè)結(jié)果不樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

Ø樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

Ø陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

Ø病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

Ø丌同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

Ø試劑運(yùn)輸，保存丌當(dāng)或試劑配制丌準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)丌準(zhǔn)確的結(jié)果；

【注意事項(xiàng)】

Ø所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；

Ø試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；

Ø反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

Ø反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

Ø使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)與用工作服；

Ø樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

Ø實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

Ø試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]婁高明，杜偉賢．偽狂犬病流行概況及豬場(chǎng)防制策略[Ｊ]．中國(guó)動(dòng)物檢疫，1999， 16（5）：43－45.

[2]殷震，劉景華．動(dòng)物病毒學(xué)[Ｍ]．北京：科學(xué)出版社，1997.

[3]朱淑芬,朱瑞良,喬彩霞.檢測(cè)偽狂犬病毒ｇＢ基因熒光定量ＰＣＲ方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32（10）:1413-1417.

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